0512 高效液相色譜法

　　高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

　　1.對儀器的一般要求和色譜條件

　　高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數據處理系統組成。色譜柱內徑一般為 2.1~4.6mm，填充劑粒徑約為 2~10μm。超高效液相色譜儀是耐超高壓、小進樣量、低死體積、高靈敏度檢測的高效液相色譜儀。

　�。�1）色譜柱

　　反相色譜柱：以鍵合非極性基團的載體為填充劑填充而成的色譜柱。常見的載體有硅膠、聚合物復合硅膠和聚合物等；常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠、辛基硅烷鍵合硅膠和苯基硅烷鍵合硅膠等。

　　正相色譜柱：用硅膠填充劑，或鍵合極性基團的硅膠填充而成的色譜柱。常見的填充劑有硅膠、氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠等。氨基鍵合硅膠和氰基鍵合硅膠也可用作反相色譜。

　　離子交換色譜柱：用離子交換填充劑填充而成的色譜柱。有陽離子交換色譜柱和陰離子交換色譜柱。

　　手性分離色譜柱：用手性填充劑填充而成的色譜柱。

　　色譜柱的內徑與長度，填充劑的形狀、粒徑與粒徑分布、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、載體表面基團殘留量，填充的致密與均勻程度等均影響色譜柱的性能，應根據被分離物質的性質來選擇合適的色譜柱。

　　溫度會影響分離效果，品種正文中未指明色譜柱溫度時系指室溫，應注意室溫變化的影響。為改善分離效果可適當調整色譜柱的溫度。

　　殘余硅羥基未封閉的硅膠色譜柱，流動相 pH 值一般應在 2~8 之間。烷基硅烷帶有立體側鏈保護、或殘余硅羥基已封閉的硅膠、聚合物復合硅膠或聚合物色譜柱可耐受更廣泛 pH 值的流動相，可用于 pH 值小于 2 或大于 8 的流動相。

　�。�2）檢測器  最常用的檢測器為紫外-可見分光檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、電霧式檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。

　　紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與被測物質的量有關，還與其結構有關；蒸發光散射檢測器、電霧式檢測器和示差折光檢測器為通用檢測器，對所有物質均有響應；結構相似的物質在蒸發光散射檢測器和電霧式檢測器的響應值幾乎僅與被測物質的量有關。

　　紫外-可見分光檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器和示差折光檢測器的響應值與被測物質的量在一定范圍內呈線性關系；蒸發光散射檢測器的響應值與被測物質的量通常呈指數關系，一般需經對數轉換；電霧式檢測器的響應值與被測物質的量通常也呈指數關系，一般需經對數轉換或用二次函數計算，但在小質量范圍內可基本呈線性。

　　不同的檢測器，對流動相的要求不同。紫外-可見分光檢測器所用流動相應符合紫外-可見分光光度法（通則 0401）項下對溶劑的要求；釆用低波長檢測時，還應考慮有機溶劑的截止使用波長。蒸發光散射檢測器、電霧式檢測器和質譜檢測器不得使用含不揮發性成分的流動相。

　�。�3）流動相  反相色譜系統的流動相常用甲醇-水系統或乙腈-水系統，用紫外末端波長檢測時，宜選用乙腈-水系統。流動相中如需使用緩沖溶液，應盡可能使用低濃度緩沖鹽。用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱時，流動相中有機溶劑一般應不低于 5%，否則易導致柱效下降、色譜系統不穩定。

　　正相色譜系統的流動相常用兩種或兩種以上的有機溶劑，如二氯甲烷和正己烷等。

　　流動相注入液相色譜儀的方式（又稱洗脫方式）可分為兩種：一種是等度洗脫，另一種是梯度洗脫。用梯度洗脫分離時，梯度洗脫程序通常以表格的形式在品種項下規定，其中包括運行時間和流動相在不同時間的成分比例。

　�。�4）色譜參數調整  品種正文項下規定的色譜條件（參數），除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進樣量、檢測器靈敏度等，均可適當調整。

　　若需使用小粒徑（約 2μm）填充劑和小內徑（約 2.1mm）色譜柱或表面多孔填充劑以提高分離度或縮短分析時間，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配，必要時，色譜條件（參數）可適當調整。

       可通過相關軟件計算表中流速、進樣體積和梯度洗脫程序的調整范圍，并根據色譜峰分離情況進行微調。

　　調整后，系統適用性應符合要求，且色譜峰出峰順序不變。若減小進樣體積，應保證檢測限和峰面積的重復性；若增加進樣體積，應使分離度和線性關系仍滿足要求。應評價色譜參數調整對分離和檢測的影響，必要時對調整色譜參數后的方法進行確認。若調整超出表中規定的范圍或品種項下規定的范圍，被認為是對方法的修改，需要進行充分的方法學驗證。

　　調整梯度洗脫色譜參數時應比調整等度洗脫色譜參數時更加謹慎，因為此調整可能會使某些峰位置變化，造成峰識別錯誤，或者與其他峰重疊。

　　當對調整色譜條件后的測定結果產生異議時，應以品種項下規定的色譜條件的測定結果為準。

　　在品種項下一般不宜指定或推薦色譜柱的品牌，但可規定色譜柱的填充劑（固定相）種類（如鍵合相，是否改性、封端等）、粒徑、孔徑，色譜柱的柱長或柱內徑；當耐用性試驗證明必須使用特定品牌的色譜柱方能滿足分離要求時，可在該品種正文項下注明。

　　2.系統適用性試驗

　　色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、靈敏度、拖尾因子和重復性等五個參數。

　　按各品種正文項下要求對色譜系統進行適用性試驗，即用規定的對照品溶液或系統適用性試驗溶液在規定的色譜系統進行試驗，必要時，可對色譜系統進行適當調整，以符合要求。

　�。�1）色譜柱的理論板數（n）  用于評價色譜柱的效能。由于不同物質在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數作為衡量色譜柱效能的指標時，應指明測定物質，一般為待測物質或內標物質的理論板數。

　　在規定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分色譜峰或內標物質色譜峰的保留時間 tR 和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按 n=16（tR/W）2 或 n=5.54（tR/Wh/2）2 計算色譜柱的理論板數。tR、W、Wh/2 可用時間或長度計（下同），但應取相同單位。

　�。�2）分離度（R）  用于評價待測物質與被分離物質之間的分離程度，是衡量色譜系統分離效能的關鍵指標�？梢酝ㄟ^測定待測物質與已知雜質的分離度，也可以通過測定待測物質與某一指標性成分（內標物質或其他難分離物質）的分離度，或將供試品或對照品用適當的方法降解，通過測定待測物質與某一降解產物的分離度，對色譜系統分離效能進行評價與調整。

　　無論是定性鑒別還是定量測定，均要求待測物質色譜峰與內標物質色譜峰或特定的雜質對照色譜峰及其他色譜峰之間有較好的分離度。除另有規定外，待測物質色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應不小于 1.5。分離度的計算公式為：

　　當對測定結果有異議時，色譜柱的理論板數（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結果為準。

　�。�3）靈敏度  用于評價色譜系統檢測微量物質的能力，通常以信噪比（S/N）來表示。建立方法時，可通過測定一系列不同濃度的供試品或對照品溶液來測定信噪比。定量測定時，信噪比應不小于 10；定性測定時，信噪比應不小于 3。系統適用性試驗中可以設置靈敏度實驗溶液來評價色譜系統的檢測能力。

　�。�4）拖尾因子（T）  用于評價色譜峰的對稱性。拖尾因子計算公式為：

　　以峰高作定量參數時，除另有規定外，T 值應在 0.95~1.05 之間。

　　以峰面積作定量參數時，一般的峰拖尾或前伸不會影響峰面積積分，但嚴重拖尾會影響基線和色譜峰起止的判斷和峰面積積分的準確性，此時應在品種正文項下對拖尾因子作出規定。

　�。�5）重復性  用于評價色譜系統連續進樣時響應值的重復性能。除另有規定外，通常取各品種項下的對照品溶液，連續進樣 5 次，其峰面積測量值（或內標比值或其校正因子）的相對標準偏差應不大于 2.0%。視進樣溶液的濃度和/或體積、色譜峰響應和分析方法所能達到的精度水平等，對相對標準偏差的要求可適當放寬或收緊，放寬或收緊的范圍以滿足品種項下檢測需要的精密度要求為準。

　　3.測定法

　　3.1  定性分析

　　常用的定性方法主要有但不限于以下：

　�。�1）利用保留時間定性

　　保留時間（retention time，tR）定義為被分離組分從進樣到柱后出現該組分最大響應值時的時間，也即從進樣到出現某組分色譜峰的頂點時為止所經歷的時間，常以分鐘（min）為時間單位，用于反映被分離的組分在性質上的差異。通常以在相同的色譜條件下待測成分的保留時間與對照品的保留時間是否一致作為待測成分定性的依據。

　　在相同的色譜條件下，待測成分的保留時間與對照品的保留時間應無顯著性差異；兩個保留時間不同的色譜峰歸屬于不同化合物，但兩個保留時間一致的色譜峰有時未必可歸屬為同一化合物，在作未知物鑒別時應特別注意。

　　若改變流動相組成或更換色譜柱的種類，待測成分的保留時間仍與對照品的保留時間一致，可進一步證實待測成分與對照品為同一化合物。

　　當待測成分（保留時間 tR，1）無對照品時，可以樣品中的另一成分或在樣品中加入另一已知成分作為參比物（保留時間 tR，2），采用相對保留時間（RRT）作為定性（或定位）的方法。在品種項下，除另有規定外，相對保留時間通常是指待測成分保留時間相對于主成分保留時間的比值，以未扣除死時間的非調整保留時間按下式計算。

　　若需以扣除死時間的調整保留時間計算，應在相應的品種項下予以注明。

　�。�2）利用光譜相似度定性

　　化合物的全波長掃描紫外-可見光區光譜圖提供一些有價值的定性信息。待測成分的光譜與對照品的光譜的相似度可用于輔助定性分析。二極管陣列檢測器開啟一定波長范圍的掃描功能時，可以獲得更多的信息，包括色譜信號、時間、波長的三維色譜光譜圖，既可用于輔助定性分析，還可用于峰純度分析。

　　同樣應注意，兩個光譜不同的色譜峰表征了不同化合物，但兩個光譜相似的色譜峰未必可歸屬為同一化合物。

　�。�3）利用質譜檢測器提供的質譜信息定性

　　利用質譜檢測器提供的色譜峰分子質量和結構的信息進行定性分析，可獲得比僅利用保留時間或增加光譜相似性進行定性分析更多的、更可靠信息，不僅可用于已知物的定性分析，還可提供未知化合物的結構信息。

　　3.2  定量分析

　�。�1）內標法

　　按品種正文項下的規定，精密稱（量）取對照品和內標物質，分別配成溶液，各精密量取適量，混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量進樣，記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：

　　再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液，進樣，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內標物質的峰面積或峰高，按下式計算含量：

　　采用內標法，可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

　�。�2）外標法

　　按各品種項下的規定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，進樣，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測物質的峰面積（或峰高），按下式計算含量：

　　式中各符號意義同上。

　　當采用外標法測定時，以手動進樣器定量環或自動進樣器進樣為宜。

　�。�3）加校正因子的主成分自身對照法

　　測定雜質含量時，可釆用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規定，精密稱（量）取待測物對照品和參比物質對照品各適量，配制待測雜質校正因子的溶液，進樣，記錄色譜圖，按下式計算待測雜質的校正因子。

　　也可精密稱（量）取主成分對照品和雜質對照品各適量，分別配制成不同濃度的溶液，進樣，記錄色譜圖，繪制主成分濃度和雜質濃度對其峰面積的回歸曲線，以主成分回歸直線斜率與雜質回歸直線斜率的比計算校正因子。

　　校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質的實測峰面積，需作校正計算的雜質，通常以主成分為參比，采用相對保留時間定位，其數值一并載入各品種項下。

　　測定雜質含量時，按各品種項下規定的雜質限度，將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液，作為對照溶液，進樣，記錄色譜圖，必要時，調節縱坐標范圍（以噪聲水平可接受為限）使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達滿量程的 10%~25%。除另有規定外，通常含量低于 0.5%的雜質，峰面積測量值的相對標準偏差（RSD）應小于 10%；含量在 0.5%~2%的雜質，峰面積測量值的 RSD 應小于 5%；含量大于 2%的雜質，峰面積測量值的 RSD 應小于 2%。然后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進樣。除另有規定外，供試品溶液的記錄時間，應為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積，分別乘以相應的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，計算各雜質含量。

　�。�4）不加校正因子的主成分自身對照法

　　測定雜質含量時，若無法獲得待測雜質的校正因子，或校正因子可以忽略，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液、進樣、調節縱坐標范圍和計算峰面積的相對標準偏差后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進樣。除另有規定外，供試品溶液的記錄時間應為主成分色譜峰保留時間的 2 倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算雜質含量。

　�。�5）面積歸一化法

　　按各品種項下的規定，配制供試品溶液，取一定量進樣，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質檢查時，由于儀器響應的線性限制，峰面積歸一化法一般不宜用于微量雜質的檢查。

　　如適用，也可使用其他方法如標準曲線法等，并在品種正文項下注明。

　　4.多維液相色譜

　　多維色譜又稱為色譜/色譜聯用技術，是采用匹配的接口將不同分離性能或特點的色譜連接起來，第一級色譜中未分離開或需要分離富集的組分由接口轉移到第二級色譜中，第二級色譜仍需進一步分離或分離富集的組分，也可以繼續通過接口轉移到第三級色譜中。理論上，可以通過接口將任意級色譜串聯或并聯起來，直至將混合物樣品中所有的難分離、需富集的組分都分離或富集之。但實際上，一般只要選用兩個合適的色譜聯用就可以滿足對絕大多數難分離混合物樣品的分離或富集要求。因此，一般的色譜/色譜聯用都是二級，即二維色譜。

　　在二維色譜的術語中，1D 和 2D 分別指一維和二維；而 1D 和 2D 則分別代表第一維和第二維。

　　二維液相色譜可以分為差異顯著的兩種主要類型：中心切割式二維色譜（heart-cutting mode two-dimensional chromatography）和全二維色譜（comprehensive two-dimensional chromatography）。中心切割式二維色譜是通過接口將前一級色譜中某一（些）組分傳遞到后一級色譜中繼續分離，一般用 LC-LC（也可用 LC+LC）表示；全二維色譜是通過接口將前一級色譜中的全部組分連續地傳遞到后一級色譜中進行分離，一般用 LC×LC 表示。此外，這兩種類型下還有若干子類，包括選擇性全二維色譜（sLC×LC）和多中心切割 2D-LC（mLC-LC）。

　　LC-LC 或 LC×LC 兩種二維色譜可以是相同的分離模式和類型，也可以是不同的分離模式和類型。接口技術是實現二維色譜分離的關鍵之一，原則上，只要有匹配的接口，任何模式和類型的色譜都可以聯用。

　　與一維色譜一樣，二維色譜也可以和質譜、紅外和核磁共振等聯用。