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                  顯微鑒別法 中國藥典2020版四部通則2001

                  中國藥典2020版四部通則2001

                  顯微鑒別法


                    顯微鑒別法系指用顯微鏡對藥材(飲片)切片、粉末、解離組織或表面制片及含飲片粉末的制劑中飲片的組織、細胞或內含物等特征進行鑒別的一種方法。鑒別時選擇具有代表性的供試品,根據各品種鑒別項的規定制片。制劑根據不同劑型適當處理后制片。

                    一、 藥材(飲片)顯微制片

                    1.橫切片或縱切片制片  取供試品欲觀察部位,經軟化處理后,用徒手或滑走切片法,切成10~20μm的薄片,必要時可包埋后切片。選取平整的薄片置載玻片上,根據觀察對象不同,滴加甘油醋酸試液、水合氯醛試液或其他試液1~2滴,蓋上蓋玻片。必要時滴加水合氯醛試液后,在酒精燈上加熱透化,并滴加甘油乙醇試液或稀甘油,蓋上蓋玻片。

                    2.粉末制片  供試品粉末過四或五號篩,挑取少許置載玻片上,滴加甘油醋酸試液、水合氯醛試液或其他適宜的試液,蓋上蓋玻片。必要時,按上法加熱透化。

                    3.表面制片  將供試品濕潤軟化后,剪取欲觀察部位約4mm2,一正一反置載玻片上,或撕取表皮,加適宜的試液或加熱透化后,蓋上蓋玻片。

                    4.解離組織制片  將供試品切成長約5mm、直徑約2mm的段或厚約1mm的片,如供試品中薄壁組織占大部分,木化組織少或分散存在,采用氫氧化鉀法,若供試品質地堅硬,木化組織較多或集成較大群束,釆用硝鉻酸法或氯酸鉀法。

                    (1)氫氧化鉀法  將供試品置試管中,加5%氫氧化鉀溶液適量,加熱至用玻璃棒擠壓能離散為止,傾去堿液,加水洗滌后,取少量置載玻片上,用解剖針撕開,滴加稀甘油,蓋上蓋玻片。

                    (2)硝鉻酸法  將供試品置試管中,加硝鉻酸試液適量,放置至用玻璃棒擠壓能離散為止,傾去酸液,加水洗滌后,照上法裝片。

                    (3)氯酸鉀法  將供試品置試管中,加硝酸溶液(1→2)及氯酸鉀少量,緩緩加熱,待產生的氣泡漸少時,再及時加入氯酸鉀少量,以維持氣泡穩定地發生,至用玻璃棒擠壓能離散為止,傾去酸液,加水洗滌后,照上法裝片。

                    5.花粉粒與孢子制片  取花粉、花藥(或小的花)、孢子或孢子囊群(干燥的供試品浸于冰醋酸中軟化),用玻璃棒研碎,經紗布過濾至離心管中,離心,取沉淀加新配制的醋酐與硫酸(9:1)的混合液1~3ml,置水浴上加熱2~3分鐘,離心,取沉淀,用水洗滌2次,取沉淀少量置載玻片上,滴加水合氯醛試液,蓋上蓋玻片,或加50%甘油與1%苯酚各1~2滴,用品紅甘油膠[取明膠1g,加水6ml,浸泡至溶化,再加甘油7ml,加熱并輕輕攪拌至完全混勻,用紗布過濾至培養皿中,加堿性品紅溶液(堿性品紅0.1g,加無水乙醇600ml及樟油80ml,溶解)適量,混勻,凝固后即得]封藏。

                    6.磨片制片  堅硬的動物、礦物類藥,可采用磨片法制片。選取厚度1~2mm的供試材料,置粗磨石(或磨砂玻璃板)上,加適量水,用食指、中指夾住或壓住材料,在磨石上往返磨礪,待兩面磨平,且厚度約數百微米時,將材料移置細磨石上,加水,用軟木塞壓在材料上,往返磨礪至透明,用水沖洗,再用乙醇處理和甘油乙醇試液裝片。

                    二、含飲片粉末的制劑顯微制片

                    按供試品不同劑型,散劑、膠囊劑(內容物為顆粒狀,應研細),可直接取適量粉末;片劑取2~3片,水丸、糊丸、水蜜丸、錠劑等(包衣者除去包衣),取數丸或1~2錠,分別置乳缽中研成粉末,取適量粉末;蜜丸應將藥丸切開,從切面由外至中央挑取適量樣品或用水脫蜜后,吸取沉淀物少量。根據觀察對象不同,分別按粉末制片法制片(1~5片)。

                    三、細胞壁性質的鑒別

                    1.木質化細胞壁   加間苯三酚試液1~2滴,稍放置,加鹽酸1滴,因木質化程度不同,顯紅色或紫紅色。

                    2.木栓化或角質化細胞壁   加蘇丹Ⅲ試液,稍放置或微熱,顯橘紅色至紅色。

                    3.纖維素細胞壁   加氯化鋅碘試液,或先加碘試液濕潤后,稍放置,再加硫酸溶液(33→50),顯藍色或紫色。

                    4.硅質化細胞壁   加硫酸無變化。

                    四、細胞內含物性質的鑒別

                    1.淀粉粒

                    (1)加碘試液,顯藍色或紫色。

                    (2)用甘油醋酸試液裝片,置偏光顯微鏡下觀察,未糊化的淀粉粒顯偏光現象;已糊化的無偏光現象。

                    2.糊粉粒

                    (1)加碘試液,顯棕色或黃棕色。

                    (2)加硝酸汞試液,顯磚紅色。材料中如含有多量脂肪油,應先用乙醚或石油醚脫脂后進行試驗。

                    3.脂肪油、揮發油、樹脂

                    (1)加蘇丹Ⅲ試液,顯橘紅色、紅色或紫紅色。

                    (2)加90%乙醇,脂肪油和樹脂不溶解(蓖麻油及巴豆油例外),揮發油則溶解。

                    4.菊糖   加10%α-萘酚乙醇溶液,再加硫酸,顯紫紅色并溶解。

                    5.黏液  加釕紅試液,顯紅色。

                    6.草酸鈣結晶

                    (1)加稀醋酸不溶解,加稀鹽酸溶解而無氣泡發生。

                    (2)加硫酸溶液(1→2)逐漸溶解,片刻后析出針狀硫酸鈣結晶。

                    7.碳酸鈣結晶(鐘乳體)   加稀鹽酸溶解,同時有氣泡發生。

                    8.硅質   加硫酸不溶解。

                    五、顯微測量

                    系指用目鏡測微尺,在顯微鏡下測量細胞及細胞內含物等的大小。

                    1.目鏡測微尺   放在目鏡筒內的一種標尺,為一個直徑18~20mm的圓形玻璃片,中央刻有精確等距離的平行線刻度,常為50格或100格(圖1)。

                    2.載物臺測微尺   在特制的載玻片中央粘貼一刻有精細尺度的圓形玻片。通常將長1mm(或2mm)精確等分成100(或200)小格,每1小格長為10μm,用以標定目鏡測微尺(圖2)。

                   image.png 

                    3.目鏡測微尺的標定   用以確定使用同一顯微鏡及特定倍數的物鏡、目鏡和鏡筒長度時,目鏡測微尺上每一格所代表的長度。

                    取載物臺測微尺置顯微鏡載物臺上,在高倍物鏡(或低倍物鏡)下,將測微尺刻度移至視野中央。將目鏡測微尺(正面向上)放入目鏡鏡筒內,旋轉目鏡,并移動載物臺測微尺,使目鏡測微尺的“0"刻度線與載物臺測微尺的某刻度線相重合,然后再找第二條重合刻度線,根據兩條重合線間兩種測微尺的小格數,計算出目鏡測微尺每一小格在該物鏡條件下相當的長度(μm),如圖3所示,目鏡測微尺77個小格(0~77)與載物臺測微尺的30個小格(0.7~1.0)相當,已知載物臺測微尺每一小格的長度為10μm。目鏡測微尺每一小格長度為:10μm×30÷77=3.8μm。

                    當測定時要用不同的放大倍數時,應分別標定。

                  image.png

                    4.測量方法   將需測量的目的物顯微制片置顯微鏡載物臺上,用目鏡測微尺測量目的物的小格數,乘以上述每一小格的微米數。通常是在高倍鏡下測量,但欲測量較長的目的物,如纖維、導管、非腺毛等的長度時,需在低倍鏡下測量。記錄最大值與最小值(μm),允許有少量數值略高或略低于規定。


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