人胰島素

Ren Yidaosu

Human Insulin

　　分子式：C257H383N65O77S6分子量：5807.69Da

　　本品系由含有可高效表達人胰島素基因的工程化細胞，經發酵、分離、高度純化、結晶和干燥制成的原料藥。人胰島素為51個氨基酸殘基組成的蛋白質。按干燥品計算，含人胰島素（包括A21脫氨人胰島素）應為95.0%～105.0%。

　　每1單位人胰島素相當于0.0347mg。

　　1  基本要求

　　生產和檢定用設施、原材料及輔料、水、器具等應符合“凡例”的有關要求。

　　2  制造

　　2.1  工程菌

　　工程菌菌種名稱、來源及種子批檢定應符合批準的要求。

　　2.2  原料

　　2.2.1  種子液制備

　　將檢定合格的工作種子批細胞接種于適宜的培養基(可含適量抗生素)中培養。

　　2.2.2  發酵用培養基

　　采用適宜的不含抗生素的培養基。

　　2.2.3  種子液接種及發酵培養

　　2.2.3.1  在滅菌培養基中接種適量種子液。

　　2.2.3.2  應根據經批準的工藝進行發酵，并確定相應的發酵條件，如溫度、pH值、溶解氧、補料、發酵時間等。如系大腸埃希菌表達，發酵液應定期進行質粒丟失率檢查(通則3406)。

　　2.2.4  發酵液處理

　　用適宜的方法收集、處理細胞。

　　2.2.5  初步純化及高度純化

　　釆用經批準的純化工藝進行初步純化和高度純化，使其純度達到規定的要求。

　　2.2.6  過濾、結晶及干燥

　　經初步純化和高度純化后，釆用經批準的結晶工藝及干燥工藝對純化收集物進行過濾、結晶和干燥，干燥品即為人胰島素原料藥。

　　2.2.7  分批

　　應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定。

　　2.2.8  包裝

　　應符合“生物制品分包裝及貯運管理”規定和批準的內容。

　　3  檢定

　　3.1  性狀

　　本品為白色或類白色粉末。

　　3.2  鑒別

　　3.2.1  在含量測定項下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應與對照品溶液主峰的保留時間一致。

　　3.2.2  取本品適量，用0.1%三氟乙酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液（pH7.3）20μl、0.1%V8酶溶液20μl與水140μl，混勻，置37℃水浴中2小時后，加磷酸3μl，作為供試品溶液；另取人胰島素對照品適量，同法制備，作為對照品溶液。照含量測定項下的色譜條件，以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液（pH2.3）-乙腈（90∶10）為流動相A、乙腈-水（50∶50）為流動相B，按下表進行梯度洗脫。取對照品溶液和供試品溶液各25μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，片段Ⅱ與片段Ⅲ之間的分離度應不小于3.4，片段Ⅱ與片段Ⅲ的拖尾因子應不大于1.5。供試品溶液的肽圖譜應與對照品溶液的肽圖譜一致。

　　3.3  檢查

　　3.3.1  有關物質

　　取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含3.5mg的溶液，作為供試品溶液。照含量測定項下的方法，以0.2mol/L硫酸鹽緩沖液（pH2.3）-乙腈（82∶18）為流動相A、乙腈-水（50∶50）為流動相B，按下表進行梯度洗脫。調節流動相比例使人胰島素主峰的保留時間約為25分鐘，系統適用性試驗應符合含量測定項下的規定。取供試品溶液20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計算，A21脫氨人胰島素不得過1.5%；其他雜質峰面積之和不得過2.0%。

　　3.3.2  高分子蛋白質

　　取本品適量，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中約含4mg的溶液，作為供試品溶液。照分子排阻色譜法（通則0514）試驗。以親水改性硅膠為填充劑（5～10μm）；以冰醋酸-乙腈-0.1%精氨酸溶液（15∶20∶65）為流動相，流速為每分鐘0.5ml，檢測波長為276nm。取人胰島素單體-二聚體對照品，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋制成每1ml中含4mg的溶液；取100μl注入液相色譜儀，人胰島素單體峰與二聚體峰的分離度應符合要求。取供試品溶液100μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，除去保留時間大于人胰島素主峰的其他峰面積；按峰面積歸一化法計算，保留時間小于人胰島素主峰的所有峰面積之和不得大于1.0%。

　　3.3.3  鋅

　　精密稱取本品適量，加0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液。另精密量取鋅單元素標準溶液（每1ml中含鋅1000μg）適量，用0.01mol/L的鹽酸溶液分別定量稀釋成每1ml含鋅0.2μg、0.4μg、0.6μg、0.8μg及1.0μg的鋅標準溶液，照原子吸收分光光度法（通則0406第一法），在213.9nm的波長處分別測定吸光度，按干燥品計，含鋅量不得大于1.0%。

　　3.3.4  干燥失重

　　取本品0.2g，在105℃干燥至恒重，減失重量不得過10.0%（通則0831）。

　　3.3.5  熾灼殘渣

　　取本品約0.2g，依法檢查（通則0841），遺留殘渣不得過2.0%。

　　3.3.6  微生物限度

　　取本品0.3g，照非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數法（通則1105），每1g供試品中需氧菌總數不得過300cfu。

　　3.3.7  細菌內毒素

　　取本品，依法檢查（通則1143），每1mg人胰島素中含內毒素的量應小于10EU。

　　3.3.8  宿主蛋白殘留量

　　取本品適量，依法檢查（通則3412或3414），或釆用經驗證并批準的適宜方法檢查，每1mg人胰島素中宿主蛋白殘留量不得過10ng。

　　3.3.9  宿主DNA殘留量

　　取本品適量，依法檢查（通則3407），或采用經驗證并批準的適宜方法檢查，每1.5mg人胰島素中宿主DNA殘留量不得過10ng。

　　3.3.10  抗生素殘留量

　　如生產（例如種子液制備）中使用抗生素，應依法檢查（通則3408），或釆用經批準的方法檢查，不應有殘余氨芐西林或其他抗生素活性。

　　3.3.11  生物學活性（至少每年測定一次）

　　取本品適量，照胰島素生物測定法（通則1211），每組的實驗動物數可減半，實驗釆用隨機設計，照生物檢定統計法（通則1431）中量反應平行線測定隨機設計法計算效價，每1mg人胰島素的效價不得少于15單位。

　　3.3.12  N末端氨基酸序列（至少每年測定一次）

　　取本品，采用氨基酸序列分析儀或其他適宜的方法測定。

　　A鏈N末端15個氨基酸序列：

　　Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln；

　　B鏈N末端15個氨基酸序列：

　　Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu。

　　3.3.13  單鏈前體

　　工藝中如有單鏈前體，應采用經批準的方法及限度進行控制。

　　3.4  含量測定

　　照高效液相色譜法（通則0512）測定。

　　色譜條件與系統適用性試驗  用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（5～10μm），0.2mol/L硫酸鹽緩沖液（取無水硫酸鈉28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺調節pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（74∶26，或適宜比例）為流動相；流速為1.0ml/min；柱溫40℃；檢測波長為214nm。取系統適用性試驗用溶液（取人胰島素對照品，用0.01mol/L鹽酸溶液制成每1ml中含1mg的溶液，室溫放置至少24小時）20μl，注入液相色譜儀，人胰島素峰和A21脫氨人胰島素峰（與人胰島素峰的相對保留時間約為1.3）的分離度不小于1.8、拖尾因子不大于1.8。

　　測定法  取本品適量，精密稱定，用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋至每1ml中約含0.35mg（約10單位）的溶液（臨用新配）。精密量取20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取人胰島素對照品適量，同法測定。按外標法以人胰島素峰與A21脫氨人胰島素峰面積之和計算，即得。

　　4  保存、運輸及有效期

　　避光，密閉，在－15℃及以下保存和運輸。自生產之日起，按批準的有效期執行。