蛋白質含量測定法
中國藥典2020版三部-三部通則0731
組成蛋白質的基本單位是氨基酸，氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈，蛋白質是一條或多條多肽鏈組成的生物大分子。不同品種應針對自身蛋白質特性選擇適宜的測定方法并做相應方法學驗證，同時應盡可能選用與待測定品種蛋白質結構相同或相近的蛋白質作對照品。
第一法 凱氏定氮法
本法系依據蛋白質為含氮的有機化合物，當與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質分解，分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定，根據酸的消耗量算出含氮量，再將含氮量乘以換算系數，即為蛋白質的含量。
本法靈敏度較低，適用于0.2～2.0mg氮的測定。氮轉化成蛋白質的換算系數因蛋白質中所含氨基酸的結構差異會稍有區別。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備，生物制品按如下方法操作。
精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時，應復溶后量�。┻m量，用0.9%氯化鈉溶液定量稀釋，制成每1ml中含氮量約1mg的溶液，精密量取1ml，作為總氮供試品溶液進行測定。非蛋白氮供試品溶液的制備，除另有規定外，照附注項下鎢酸沉淀法操作，即得。
測定法 除另有規定外，按測定法（1）操作，生物制品按測定法（2）操作。
�。�1）本測定法適用于不含無機含氮物質及有機非蛋白質含氮物質的供試品。精密量取各品種項下規定的供試品溶液適量，置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（通則0704第二法或第三法）測定供試品溶液的含氮量。除另有規定外，氮轉換為蛋白質的換算系數為6.25。
�。�2）本測定法適用于添加無機含氮物質及有機非蛋白質含氮物質的供試品。除另有規定外，精密量取各品種項下規定的總氮及非蛋白氮供試品溶液適量，分別置凱氏定氮瓶中，照氮測定法（通則0704第二法或第三法）測定，以總氮量減去非蛋白氮量即為供試品溶液的含氮量。除另有規定外，氮轉換為蛋白質的換算系數為6.25。
【附注】非蛋白氮供試品溶液制備常用方法
鎢酸沉淀法 精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時，應復溶后量�。┻m量（蛋白質含量不高于0.2g），置20ml量瓶中，加水10ml，加10%鎢酸鈉溶液2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2ml，加水至刻度�；蚓芰咳∩鲜龉┰嚻�2ml，加水14.0ml，10%鎢酸鈉溶液2.0ml，0.33mol/L硫酸溶液2.0ml。搖勻，靜置30分鐘，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得（可依據蛋白質濃度適當調整10%鎢酸鈉溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量，使鎢酸終濃度保持1%）。
三氯醋酸沉淀法 精密量取供試品（如供試品為凍干制劑或固體粉末時，應復溶后量�。┻m量（蛋白質含量6～12mg），加等體積的10%三氯醋酸溶液，混勻，靜置30分鐘，濾過，棄去初濾液，取續濾液，即得（可依據蛋白質濃度適當調整10%三氯醋酸溶液用量，使三氯醋酸終濃度保持5%）。
第二法 福林酚法（Lowry法）
本法系依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質-銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
本法靈敏度高，測定范圍為20～250μg。但對本法產生干擾的物質較多，對雙縮脲反應產生干擾的離子，同樣容易干擾福林酚反應，且影響更大。如還原物質、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。
除另有規定外，按方法1操作；如有干擾物質時，除另有規定外，按方法2操作并需經方法學驗證。
方法1：
試劑 堿性銅試液 取氫氧化鈉10g，碳酸鈉50g，加水400ml使溶解，作為甲液；取酒石酸鉀0.5g，加水50ml使溶解，另取硫酸銅0.25g，加水30ml使溶解，將兩液混合作為乙液。臨用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。
對照品溶液的制備 除另有規定外，取血清白蛋白（牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備（蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。
測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（對照品溶液取用量可在本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再分別加入堿性銅試液1.0ml，搖勻，室溫放置10分鐘，各加入福林酚試液[取福林試液中的貯備液（2mol/L酸濃度）1→16]4.0ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在650nm的波長處測定吸光度；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
方法2：
測定前將脫氧膽酸鹽-三氯醋酸加入樣品中，通過將蛋白質沉淀來去除干擾物質。這種方法也可用于將稀溶液中的蛋白質濃集。
試劑 試液A 取1%氫氧化鈉溶液200ml與5%碳酸鈉溶液200ml混合，加水稀釋至500ml。
試液B 取2.98%二水合酒石酸二鈉溶液100ml與1.25%硫酸銅溶液100ml混合，加水稀釋至250ml，臨用新制。
試液C 取試液A與試液B按50：1的比例混合，臨用新制。
福林酚試液 取福林試液中的貯備液（2mol/L酸濃度）1→2（所配得的福林酚試液應滿足以下要求：取供試品溶液1ml，加試液C 5ml和配好的福林酚試液0.5ml，所得溶液的pH值應為10.3±0.3。若溶液pH值超出范圍，應適當調整福林酚試液的稀釋倍數）。
去氧膽酸鈉試液 取去氧膽酸鈉適量，加水制成每1ml中含1.5mg的溶液。
對照品溶液的制備 除另有規定外，取血清白蛋白（牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品適量，加水分別制成每1ml中含0.00mg、0.01mg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的溶液（對照品溶液濃度可在本法測定范圍內進行適當調整）。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備（蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。
測定法 精密量取各對照品溶液1.0ml，分別置玻璃試管中，加入去氧膽酸鈉試液0.1ml，渦旋混勻，室溫放置10分鐘，加入72%三氯醋酸溶液0.1ml，渦旋混勻，在3000g條件下離心30分鐘，輕輕倒出上清液，用吸管將剩余液體移除。蛋白質沉淀用試液C 1ml復溶后，再加入試液C 5ml，混勻，室溫放置10分鐘，加入福林酚試液0.5ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在750nm的波長處測定吸光度；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液1.0ml，同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
第三法 雙縮脲法
本法系依據蛋白質分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡合物，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
本法快速、靈敏度低，測定范圍通�？蛇_1～10mg。本法干擾測定的物質主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和某些氨基酸等。
試劑 雙縮脲試液 取硫酸銅1.5g、酒石酸鉀鈉6.0g和碘化鉀5.0g，加水500ml使溶解，邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300ml，用水稀釋至1000ml，混勻，即得。
對照品溶液的制備 除另有規定外，取血清白蛋白（牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并制成每1ml中含10mg的溶液。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備（蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。
測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml（對照品溶液取用量可在本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各加水至1.0ml，再分別加入雙縮脲試液4.0ml，立即混勻，室溫放置30分鐘，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在540nm的波長處測定吸光度；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法操作。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
第四法 2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸法（BCA法）
本法系依據蛋白質分子在堿性溶液中將Cu2+還原為Cu+，2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸（BCA）與Cu+結合形成紫色復合物，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
本法靈敏度較高，測定范圍可達80～400μg。本法測定的供試品中不能有還原劑和銅螯合物，否則干擾測定。
試劑 銅-BCA試液 取 2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸鈉1g，無水碳酸鈉2g，酒石酸鈉0.16g，氫氧化鈉0.4g與碳酸氫鈉0.95g，加水使溶解成100ml，調節pH值至11.25，作為甲液；另取4%硫酸銅溶液作為乙液。臨用前取甲液100ml，加入乙液2ml，混勻，即得。
對照品溶液的制備 除另有規定外，取血清白蛋白（牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備（蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。
測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml（對照品溶液取用量可在本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各加水至0.5ml，再分別加入銅-BCA試液10.0ml，立即混勻，置37℃水浴中保溫30分鐘，放冷，照紫外-可見分光光度法（通則0401），立即在562nm的波長處測定吸光度；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
第五法 考馬斯亮藍法（Bradford法）
本法系依據在酸性溶液中考馬斯亮藍G250與蛋白質分子中的堿性氨基酸（精氨酸）和芳香族氨基酸結合形成藍色復合物，在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比，以蛋白質對照品溶液作標準曲線，采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
本法靈敏度高，通�？蓽y定1～200μg的蛋白質量。本法主要的干擾物質有去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）等，供試品緩沖液呈強堿性時也會影響顯色。
試劑 酸性染色液 取考馬斯亮藍G250 0.1g，加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀釋至1000ml，混勻。濾過，取濾液，即得。本試劑應置棕色瓶內，如有沉淀產生，使用前需經濾過。
對照品溶液的制備 除另有規定外，取血清白蛋白（牛）對照品或蛋白質含量測定國家標準品，加水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。
供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備（蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致）。
測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml（對照品溶液取用量可在本法測定范圍內進行適當調整），分別置具塞試管中，各加水至0.1ml，再分別加入酸性染色液5.0ml，立即混勻，照紫外-可見分光光度法（通則0401），立即在595nm的波長處測定吸光度；同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量，同法測定，從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度，并乘以稀釋倍數，即得。
【附注】本法測定時不可使用可與染色物結合的比色皿（如石英比色皿），建議使用玻璃比色皿或其他適宜材料的比色皿。
第六法 紫外-可見分光光度法
本法系依據蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波長處具最大吸光度，在一定范圍內其吸光度大小與蛋白質濃度呈正比。
本法操作簡便快速，適用于純化蛋白質的檢測，一般供試品濃度為0.2～2mg/ml。本法準確度較差，干擾物質多。測定法（2）適用于供試品溶液中存在核酸時的蛋白質測定。
對照品溶液與供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備。
測定法�。�1）取供試品溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm的波長處測定吸光度，以吸收系數法或對照品比較法計算供試品中蛋白質的含量。
�。�2）取供試品溶液，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在280nm與260nm的波長處測定吸光度，按下式計算供試品中蛋白質的含量。
蛋白質濃度（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260
