中國藥典2020版四部通則3605

細菌生化反應培養基

　　下列各類培養基常用于測定細菌的糖類代謝試驗、氨基酸和蛋白質代謝試驗、碳源和氮源利用試驗等生化反應。

　　1.糖、醇發酵培養基

　�。�1）成分

　　基礎液

　　蛋白胨                                                                                              10g

　　氯化鈉                                                                                                5g

　　0.5%酸性品紅指示液                                                                            10ml

　�。ɑ�0.4%溴麝香草酚藍指示液）                                                    （6ml）

　　水                                                                                                1000ml

　　糖、醇類                                                             每100ml基礎液內各加0.5g

　�。�2）制法 取蛋白胨和氯化鈉加入水中，微溫使溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入指示液混勻。每100ml分別加入1種糖、醇或糖苷，混勻后分裝于小管中（若需觀察產氣反應，在小管內另放置杜漢小倒管）。于116℃滅菌15分鐘。

　　常用的糖、醇或糖苷：阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、蕈糖、纖維二糖、蜜二糖、棉子糖、松三糖、菊糖、糊精、淀粉、甘露醇、衛矛醇、山梨醇、肌醇、甘油、水楊素、七葉苷等。

　　(3) 用途 鑒別各種細菌對糖類的發酵生化反應，發酵者產酸，培養基變色(加酸性品紅者由無色至紅色或再至黃色；加溴麝香草酚藍者由藍色至黃色)；產氣時，小倒管內有小氣泡。

　　2.七葉苷培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨         5g 七葉苷 3g

　　磷酸氫二鉀 1g 水 1000ml

　　枸櫞酸鐵 0.5g

　　(2)制法 除七葉苷外，取上述成分混合，微溫使溶解，加入七葉苷混勻，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于試管中，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌對七葉苷的水解試驗，產生棕黑色沉淀為陽性反應。

　　3.磷酸鹽葡萄糖胨水培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨        7g   葡萄糖 5g

　　磷酸氫二鉀 3.8g水 1000ml

　　(2)制法 取上述成分混合，微溫使溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌的甲基紅試驗(M-R反應)和乙酰甲基甲醇試驗(V-P反應)。

　�、偌谆�紅試驗(M-R反應) 取可疑菌落或斜面培養物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中，置35℃培養2~5天，于培養管內加入甲基紅指示液(稱取甲基紅0.1g，加95%乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml)數滴，立即觀察，呈鮮紅色或橘紅色為陽性，呈黃色為陰性。

　�、谝阴＜谆�甲醇生成試驗(V-P反應) 取可疑菌落或斜面培養物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中，置35℃培養48小時，量取2ml培養液，加入α-萘酚乙醇試液(稱取α-萘酚5g，加無水乙醇溶解使成100ml)1ml，混勻，再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分振搖，立刻或數分鐘內出現紅色，即為陽性反應；無紅色反應為陰性，如為陰性反應，置35℃水浴4小時后再觀察。

　　4.蛋白胨水培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨 10g 水 1000ml

　　氯化鈉 5g

　　(2)制法 取上述成分混合，微溫使溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌能否分解色氨酸而產生靛基質的生化反應。

　�、俚寤�質試驗 取可疑菌落或斜面培養物，接種于蛋白胨水培養基中，置35℃培養24~48小時，必要時培養4~5天，沿管壁加入靛基質試液數滴，液面呈玫瑰紅色為陽性，呈試劑本色為陰性。

　�、诘寤�質試液 稱取對二甲氨基苯甲醛5g，加入戊醇(或異戊醇)75ml，充分振搖，使完全溶解后，再取鹽酸25ml徐徐滴入，邊加邊振搖，以免驟熱導致溶液色澤變深�；蚍Q取對二甲氨基苯甲醛1g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，再取鹽酸20ml徐徐滴入。

　　5.三糖鐵瓊脂培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨        20g 硫酸亞鐵    0.2g

　　牛肉浸出粉 5g 硫代硫酸鈉 0.2g

　　乳糖     10g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

　　蔗糖  10g 瓊脂                        12~15g

　　葡萄糖 1g 水                      1000ml

　　氯化鈉 5g

　　(2)制法 除乳糖、蔗糖、葡萄糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶脹后，再加入其余成分，搖勻，分裝，121℃滅菌15分鐘，制成高底層(2~3cm)短斜面。

　　(3)用途 用于初步鑒別腸桿菌科細菌對糖類的發酵反應和產生硫化氫試驗。

　　方法和結果觀察：取可疑菌落或斜面培養物，做高層穿刺和斜面劃線接種，置35℃培養24~48小時，觀察結果。培養基底層變黃色為葡萄糖發酵陽性，斜面層變黃色為乳糖、蔗糖發酵陽性；底層或整個培養基呈黑色表示產生硫化氫。

　　6.克氏雙糖鐵瓊脂培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨        20g 枸櫞酸鐵 0.3g

　　牛肉浸出粉 3g 硫代硫酸鈉 0.3g

　　酵母浸粉      3g 0.2%酚磺酞指示液 12.5ml

　　乳糖               10g 瓊脂         12~15g

　　葡萄糖        1g 水        1000ml

　　氯化鈉 5g

　　(2)制法 除乳糖、葡萄糖、指示液、瓊脂外，取上述成分，混合，加熱使溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，加入瓊脂，加熱溶脹后，再加入其余成分，搖勻，分裝，121℃滅菌15分鐘，制成高底層(2~3cm)短斜面。

　　(3)用途 用于初步鑒別腸桿菌科細菌對糖類的發酵反應和產生硫化氫試驗。

　　方法和結果觀察：取可疑菌落或斜面培養物，做高層穿刺和斜面劃線接種，置35℃培養24~48小時，觀察結果。培養基底層變黃色為葡萄糖發酵陽性，斜面層呈黃色為乳糖發酵陽性，斜面層呈紅色為乳糖發酵陰性；底層或整個培養基呈黑色表示產生硫化氫。

　　7.脲(尿素)培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨 1g 0.2%酚紅溶液 6ml

　　葡萄糖 1g 20%無菌脲溶液100ml

　　氯化鈉 5g 水 1000ml

　　磷酸氫二鉀 2g

　　(2)制法 除脲溶液外，取上述成分，混合，調pH值使滅菌后為6.9±0.1，混勻后，121℃滅菌15分鐘，冷至50~55℃，加入無菌脲溶液(經膜除菌過濾)，混勻，分裝于滅菌試管中。

　　(3)用途 用于鑒別細菌的尿素酶反應。

　　方法和結果觀察：取可疑菌落或少量斜面培養物接種于培養基內，置35℃培養24小時，觀察結果。培養基變為紅色為尿素酶反應陽性；不變色為陰性，陰性者需延長觀察至1周。

　　8.苯丙氨酸瓊脂培養基

　　(1)成分

　　磷酸氫二鈉 1g 氯化鈉 5g

　　酵母浸膏    3g 瓊脂 12~15g

　　DL-苯丙氨酸(DL-phenylalanine) 2g 水 1000ml

　　(或L-苯丙氨酸) (1g)

　　(2)制法 除瓊脂外，取各成分溶于水，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，再加入瓊脂，加熱溶脹，分裝試管，121℃滅菌15分鐘，制成長斜面。

　　(3)用途 用于鑒別細菌的苯丙氨酸脫氨酶試驗(也稱苯丙酮酸試驗)。

　　方法和結果觀察：取斜面培養物，大量接種于苯丙氨酸瓊脂斜面，置35℃培養4小時或18~24小時，取4~5滴10%三氯化鐵溶液試劑，由斜面上部流下，若出現墨綠色，即為苯丙氨酸脫氨酶試驗陽性；倘若不變色則為陰性。

　　9.氨基酸脫羧酶試驗培養基

　　(1)成分

　�、倩�礎液

　　蛋白胨 5g 1.6%溴甲酚紫指示液 1ml

　　酵母浸出粉 3g 水 1000ml

　　葡萄糖 1g

　�、诎被�酸

　　L-賴氨酸 0.5g (需加堿溶液溶解)

　　L-鳥氨酸 0.5g (需加堿溶液溶解)

　　L-精氨酸 0.5g (不需加堿溶液溶解)

　　(2)制法 先配制基礎液備用；將溶解后的3種氨基酸，各分別加至100ml基礎液(使氨基酸的終濃度為0.5%)，混勻，調pH值使滅菌后為6.8。分裝于小試管中，每管2.5ml并滴加1層液狀石蠟；同時分裝一部分基礎液于小試管，作為對照培養基，均置116℃滅菌10分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌的脫羧酶、雙水解酶試驗。

　　方法和結果觀察：取疑似菌斜面培養物分別接種于上述3種培養基及基礎液對照培養基，置35C培養24~48小時。在培養初期由于待檢細菌發酵葡萄糖產酸，試驗培養基和對照培養基應呈黃色，繼續培養時，試驗培養基如呈紫色或紫紅色，即為陽性反應；如至培養末期，培養基仍同對照管呈黃色，則判為陰性反應。

　　10.明膠培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨 5g 明膠 120g

　　牛肉浸出粉     3g 水 1000ml

　　(2)制法 取上述成分加入水中，浸泡約20分鐘，加熱溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于細菌的明膠液化試驗。

　　方法和結果觀察：取少量待檢菌斜面培養物穿刺接種于明膠培養基內，置35℃培養24小時，取出置冰箱內10~20分鐘。如培養基仍呈溶液狀，則為陽性；培養基重新凝固，則為陰性。細菌液化明膠之作用有時甚為緩慢，如未見液化，需繼續培養1~2周方可確定陰性。

　　11.丙二酸鈉培養基

　　(1)成分

　　酵母浸出粉 1g 磷酸二氫鉀 0.4g

　　氯化鈉 2g 丙二酸鈉 3g

　　葡萄糖 0.25g 0.4%溴麝香草酚藍指示液 6ml

　　硫酸銨 2g 水 1000ml

　　磷酸氫二鉀 0.6g

　　(2)制法 除指示液外，將上述成分溶解，調pH值使滅菌后為6.8，再加入指示液。分裝小管中，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌能否利用丙二酸鈉作為碳源而生長繁殖。

　　方法和結果觀察：取斜面或肉湯培養物接種于丙二酸鈉培養基內，置35℃培養48小時。于24小時和48小時后各觀察1次結果。培養基顏色由綠色變成藍色為陽性反應；無顏色變化，或由綠色變成黃色，則為陰性反應。

　　12.枸櫞酸鹽培養基

　　(1)成分

　　氯化鈉 5g 枸櫞酸鈉(無水) 2g

　　硫酸鎂 0.2g 1.0%溴麝香草酚藍指示液 10ml

　　磷酸氫二鉀 1g 瓊脂 14g

　　磷酸二氫銨 1g 水 1000ml

　　(2)制法 除指示液和瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調pH值使滅菌后為6.9±0.1，加入瓊脂，加熱溶脹，然后加入指示液，混勻，分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘，制成斜面。

　　(3)用途 用于鑒別細菌能否利用枸櫞酸鹽作為碳源和氮源而生長繁殖。

　　方法和結果觀察：取可疑菌落或斜面培養物，接種于枸櫞酸鹽培養基的斜面上，一般培養48~72小時，凡能在培養基斜面生長出菌落，培養基即由綠色變成藍色者為陽性反應；無菌落生長，培養基仍綠色者為陰性反應，陰性反應者應繼續培養觀察至7天。

　　13.硝酸鹽胨水培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨 10g 硝酸鉀 2g

　　酵母浸出粉3g 水 1000ml

　　(2)制法 取上述成分，加熱溶解，調pH值使滅菌后為7.3±0.1，分裝于小試管中，121℃滅菌15分鐘。

　　(3)用途 用于鑒別細菌能否還原硝酸鹽成亞硝酸鹽。

　　方法和結果觀察：取待檢菌培養物接種于硝酸鹽胨水培養基中，置35℃培養24小時。將下列甲液和乙液于用前等量混合，每個培養物加混合物0.1ml，產生紅色為陽性反應，不產生紅色為陰性反應。

　　甲液：稱取α-萘胺5g，溶解于5mol/L醋酸1000ml中。

　　乙液：稱取磺胺酸(對氨基苯磺酸)8g，溶解于5mol/L醋酸1000ml中。

　　14.石蕊牛奶培養基

　　(1)成分

　　脫脂奶粉 10g 水100ml

　　10%石蕊溶液 0.65ml

　　(2)制法 取上述成分混勻后，分裝于小試管中，116℃滅菌10分鐘。

　　(3)用途 用于檢查細菌對牛奶的凝固和發酵作用。

　　15.半固體營養瓊脂培養基

　　(1)成分

　　蛋白胨 10g 瓊脂 4g

　　牛肉浸出粉 3g 水 1000ml

　　氯化鈉 5g

　　(2)制法 除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫使溶解，調pH值使滅菌后為7.2±0.2，再加入瓊脂，加熱溶脹，分裝于小管中，121℃滅菌15分鐘后，直立放置。待凝固后備用。

　　(3)用途  用于觀察細菌的動力，也可用于一般菌種的保存。

　　細菌動力檢查：取疑似菌斜面培養物穿刺接種于半固體營養瓊脂培養基中，置35℃培養24小時，細菌沿穿刺外周擴散生長，為動力陽性；否則為陰性。陰性者，應再繼續培養觀察2~3天。