中國藥典2020版三部三部通則1143

細菌內毒素檢查法

　　本法系利用鱟試劑來檢測或量化由革蘭陰性菌產生的細菌內毒素，以判斷供試品中細菌內毒素的限量是否符合規定的一種方法。

　　細菌內毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質法。供試品檢測時，可使用其中任何一種方法進行試驗。當測定結果有爭議時，除另有規定外，以凝膠限度試驗結果為準。

　　本試驗操作過程應防止內毒素的污染。

　　細菌內毒素的量用內毒素單位（EU）表示，1EU與1個內毒素國際單位（IU）相當。

　　細菌內毒素國家標準品系自大腸埃希菌提取精制，并以細菌內毒素國際標準品標定其效價。用于標定、復核、仲裁鱟試劑靈敏度、標定細菌內毒素工作標準品的效價，干擾試驗及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。

　　細菌內毒素工作標準品系以細菌內毒素國家標準品為基準標定其效價，用于干擾試驗及檢查法中編號B和C溶液的制備、凝膠法中鱟試劑靈敏度復核試驗、光度測定法中標準曲線可靠性試驗。

　　細菌內毒素檢查用水應符合滅菌注射用水標準，其內毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝膠法）或小于0.005EU/ml（用于光度測定法），且對內毒素試驗無干擾作用。

　　鱟試劑是從鱟的血液中提取出的凍干試劑，可以與細菌內毒素發生凝集反應。除了內毒素，鱟試劑還與某些β-葡聚糖反應，產生假陽性結果。如遇含有β-葡聚糖的樣品，可使用去G因子鱟試劑或G因子反應抑制劑來排除鱟試劑與β-葡聚糖的反應。

　　試驗所用的器皿需經處理，以去除可能存在的外源性內毒素。耐熱器皿常用干熱滅菌法(250℃、至少30分鐘)去除，也可采用其他確證不干擾細菌內毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器具，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應選用標明無內毒素并且對試驗無干擾的器具。

　　供試品溶液的制備　某些供試品需進行復溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。必要時，可調節被測溶液(或其稀釋液)的pH值，一般供試品溶液和鱟試劑混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范圍內為宜，可使用適宜的酸、堿溶液或緩沖液調節pH值。酸或堿溶液須用細菌內毒素檢查用水在已去除內毒素的容器中配制。所用溶劑、酸堿溶液及緩沖液應不含內毒素和干擾因子。

　　內毒素限值的確定  藥品、生物制品的細菌內毒素限值（L）一般按以下公式確定：

　　L=K/M

　　式中　L　為供試品的細菌內毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性單位）表示；

　　K　為人每千克體重每小時最大可接受的內毒素劑量，以EU/（kg・h）表示，注射劑K=5EU/（kg・h），放射性藥品注射劑K=2.5EU/（kg・h），鞘內用注射劑K=0.2EU/（kg・h）；

　　M　為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/（kg・h）、mg/（kg・h）或U/（kg・h）表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62m2計算。注射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體重劑量（M）。

　　按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據生產和臨床用藥實際情況做必要調整，但需說明理由。

　　確定最大有效稀釋倍數（MVD）　最大有效稀釋倍數是指在試驗中供試品溶液被允許達到稀釋的最大倍數，在不超過此稀釋倍數的濃度下進行內毒素限值的檢測。用以下公式來確定MVD：

　　MVD=cL/λ

　　式中　L　為供試品的細菌內毒素限值；

　　c　為供試品溶液的濃度，當L以EU/mg或EU/U表示時，c的單位需為mg/ml或U/ml，當L以EU/ml表示時，則c等于1.0ml/ml。如需計算在MVD時的供試品濃度，即最小有效稀釋濃度，可使用公式c=λ/L；

　　λ　為在凝膠法中鱟試劑的標示靈敏度(EU/ml)，或是在光度測定法中所使用的標準曲線上最低的內毒素濃度。

　　方法1　凝膠法

　　凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理進行限度檢測或半定量檢測內毒素的方法。

　　鱟試劑靈敏度復核試驗　在本檢查法規定的條件下，使鱟試劑產生凝集的內毒素的最低濃度即為鱟試劑的標示靈敏度，用EU/ml表示。當使用新批號的鱟試劑或試驗條件發生了任何可能影響檢驗結果的改變時，應進行鱟試劑靈敏度復核試驗。

　　根據鱟試劑靈敏度的標示值（λ），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作，然后制成2λ、λ、0.5λ和0.25λ四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒或參照標準品說明書中要求的混勻時間進行操作。取不同濃度的內毒素標準溶液，分別與等體積（如0.1ml）的鱟試劑溶液混合，每一個內毒素濃度平行做4管；另外取2管加入等體積的細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃的恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。

　　將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉180°，若管內形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性。保溫和拿取試管過程應避免受到振動，造成假陰性結果。

　　當最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。

　　λc=antilg（∑X/n）

　　式中　X 為反應終點濃度的對數值(lg)。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度；

　　n 為每個濃度的平行管數。

　　當λc在0.5～2λ(包括0.5λ和2λ)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度λ為該批鱟試劑的靈敏度。

　　干擾試驗　按表1制備溶液A、B、C和D，使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數(MVD)的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

　　只有當溶液A和陰性對照溶液D的所有平行管都為陰性，并且系列溶液C的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，試驗方為有效。當系列溶液B的結果符合鱟試劑靈敏度復核試驗要求時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。其他情況則認為供試品在該濃度下存在干擾作用。若供試品溶液在小于MVD的稀釋倍數下對試驗有干擾，應將供試品溶液進行不超過MVD的進一步稀釋，再重復干擾試驗。

　　可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法(如過濾、中和、透析或加熱處理等)排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。

　　當進行新藥的內毒素檢查試驗前，或無內毒素檢查項的品種建立內毒素檢查法時，須進行干擾試驗。

　　當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。

　　檢查法

　�。�1）凝膠限度試驗

　　按表2制備溶液A、B、C和D。使用稀釋倍數不超過MVD并且已經排除干擾的供試品溶液來制備溶液A和B。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

　　結果判斷  保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效。

　　若溶液A的兩個平行管均為陰性，判定供試品符合規定。若溶液A的兩個平行管均為陽性，判定供試品不符合規定。若溶液A的兩個平行管中的一管為陽性，另一管為陰性，需進行復試。復試時溶液A需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判定供試品符合規定，否則判定供試品不符合規定。

　　若供試品的稀釋倍數小于MVD而溶液A結果出現不符合規定時，可將供試品稀釋至MVD重新實驗，再對結果進行判斷。

　�。�2）凝膠半定量試驗

　　本方法系通過確定反應終點濃度來量化供試品中內毒素的含量。按表3制備溶液A、B、C和D。按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。

　　結果判斷  若陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值在0.5～2λ，試驗有效。

　　系列溶液A中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以λ，為每個系列的反應終點濃度。如果檢驗的是經稀釋的供試品，則將終點濃度乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數，即得到每一系列內毒素濃度c。

　　若每一系列內毒素濃度均小于規定的限值，判定供試品符合規定。每一系列內毒素濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度［按公式cE=antilg（∑lgc/2）]。若試驗中供試品溶液的所有平行管均為陰性，應記為內毒素濃度小于λ（如果檢驗的是稀釋過的供試品，則記為小于λ乘以供試品進行半定量試驗的初始稀釋倍數）。

　　若任何系列內毒素濃度不小于規定的限值時，則判定供試品不符合規定。當供試品溶液的所有平行管均為陽性，可記為內毒素的濃度大于或等于最大的稀釋倍數乘以λ。

　　方法2  光度測定法

　　光度測定法分為濁度法和顯色基質法。

　　濁度法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中的濁度變化而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，可分為終點濁度法和動態濁度法。終點濁度法是依據反應混合物中的內毒素濃度和其在孵育終止時的濁度（吸光度或透光率）之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態濁度法是檢測反應混合物的濁度到達某一預先設定的吸光度或透光率所需要的反應時間，或是檢測濁度增加速度的方法。

　　顯色基質法系利用檢測鱟試劑與內毒素反應過程中產生的凝固酶使特定底物釋放出呈色團的多少而測定內毒素含量的方法。根據檢測原理，分為終點顯色法和動態顯色法。終點顯色法是依據反應混合物中內毒素濃度和其在孵育終止時釋放出的呈色團的量之間存在的量化關系來測定內毒素含量的方法。動態顯色法是檢測反應混合物的吸光度或透光率達到某一預先設定的檢測值所需要的反應時間，或檢測值增加速度的方法。

　　光度測定試驗需在特定的儀器中進行，溫度一般為37℃±1℃。

　　供試品和鱟試劑的加樣量、供試品和鱟試劑的比例以及保溫時間等，參照所用儀器和試劑的有關說明進行。

　　為保證濁度和顯色試驗的有效性，應預先進行標準曲線的可靠性試驗以及供試品的干擾試驗。

　　標準曲線的可靠性試驗　當使用新批號的鱟試劑或試驗條件有任何可能會影響檢驗結果的改變時，需進行標準曲線的可靠性試驗。

　　用標準內毒素制成溶液，制成至少3個濃度的稀釋液（相鄰濃度間稀釋倍數不得大于10），最低濃度不得低于所用鱟試劑的標示檢測限。每一稀釋步驟的混勻時間同凝膠法，每一濃度至少做3支平行管。同時要求做2支陰性對照，當陰性對照的吸光度小于或透光率大于標準曲線最低點的檢測值或反應時間大于標準曲線最低點的反應時間，將全部數據進行線性回歸分析。

　　根據線性回歸分析，標準曲線的相關系數（r）的絕對值應大于或等于0.980，試驗方為有效。否則須重新試驗。

　　干擾試驗  選擇標準曲線中點或一個靠近中點的內毒素濃度（設為λm），作為供試品干擾試驗中添加的內毒素濃度。按表4制備溶液A、B、C和D。

　　按所得線性回歸方程分別計算出供試品溶液和含標準內毒素的供試品溶液的內毒素含量ct和cs，再按下式計算該試驗條件下的回收率（R）。

　　R=（cs－ct）/λm×100%

　　當內毒素的回收率在50%～200%，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。

　　當內毒素的回收率不在指定的范圍內，須按“凝膠法干擾試驗”中的方法去除干擾因素，并重復干擾試驗來驗證處理的有效性。

　　當鱟試劑、供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境等發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。

　　檢查法　按“光度測定法的干擾試驗”中的操作步驟進行檢測。

　　使用系列溶液C生成的標準曲線來計算溶液A的每一個平行管的內毒素濃度。

　　試驗必須符合以下三個條件方為有效：

　�。�1）系列溶液C的結果要符合“標準曲線的可靠性試驗”，中的要求；

　�。�2）用溶液B中的內毒素濃度減去溶液A中的內毒素濃度后，計算出的內毒素的回收率要在50%～200%的范圍內；

　�。�3）陰性對照吸光度小于或透光率大于標準曲線最低點的檢測值或反應時間大于標準曲線最低點的反應時間。

　　結果判斷　若供試品溶液所有平行管的平均內毒素濃度乘以稀釋倍數后，小于規定的內毒素限值，判定供試品符合規定。若大于或等于規定的內毒素限值，判定供試品不符合規定。

　　注：本檢查法中，“管”的意思包括其他任何反應容器，如微孔板中的孔。